微生物操作中常见问题的讨论与分析
1、划不出单个菌落的原因：
（1）平板上有过多的水分；
（2）划线时接种环未经反复灼烧；
（3）多区划线，三区或四区划线。
2、涂布和倾注的区别：
涂布利于观察，但由于涂布棒上会带有少量的菌液，可能影响计数的准确性；倾注更为准确，但不利于观察菌落的状态。
Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大量比较试验后发现，对霉菌计数来说，涂抹法有以下几方面优y越于倾注法：
①培养出的霉菌菌落数较多；
②培养所需的时间较短；
③霉菌孢子、菌落形态特征发育完w全，便于鉴定。
这是因为绝大多数霉菌是好氧的，在培养基表面生长快，发育好，而混在培养基中发育就受影响，而且在培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。
3、培养基的选择：
培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO)，其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长，而CAO则适合于高渗性霉菌生长，酵母菌几乎不长。
在日常检测中我们发现，有些常见的耐高渗性霉菌，如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长，而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方：蔗糖400g，麦芽提取汁20g，酵母提取汁5g，琼脂20g，氯l霉素50mg，蒸馏水1000ml；DG18琼脂配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，氯l霉素0.1g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，PH6.5)上则正常生长。孢子、形态特征发育良好，而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长，因此，若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌，将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等，更有必要同时采用M40Y或DG18。
由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素，危害较小，而有的菌株即使污染数量不多，但其产生的霉菌毒素却危害较大，因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判断被污染食品的安全程度。
为此，国外有些研究者设计出各类选择性培养基，可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方：酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落，非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。
4、培养基配制时应注意的问题：
(1)灭菌温度要严格控制，按照要求灭菌，尤其含糖量较高的培养基温度不应太高，过高会导致糖分焦化，影响质量；
(2)琼脂培养基不能反复溶化。反复溶化会破坏培养基中的营养成分；
(3)培养基不能反复灭菌，反复灭菌也会导致营养成分的破坏；
(4)含琼脂的培养基灭菌后，要摇匀。
5、平板的保存：
大多数平板如VRBA、DC、尿素酶生化管、显色系列等要避光低温保存。
6、产品的保存：
(1)干粉培养基：避光干燥，结块后不能使用。
(2)亚碲酸钾卵黄增菌液、50%卵黄乳液等：冷冻保存，使用时，要常温解冻，避免水浴加热。
(3)抗生素类：冷藏保存，温度过高会导致灵敏度的下降。
(4)兔血浆：冷藏保存少量的红色不会影响结果。
7、添加剂的添加：
（1）温度的掌握。卵黄和抗生素类添加的温度都不应太高。
（2）定量。过多会抑制一些目标菌，太少又导致杂菌的过度生长。
8、培养温度的掌握：
（1）真菌类。25-28℃培养
（2）细菌类。李氏菌在增菌和生化中要求培养温度在30℃左右。
（3）其他，一般在36℃左右。
9、接种方法：
常用的方法主要有划线、三点接种、穿刺接种、倾注接种、涂布接种、液体接种。
10、革兰氏染色方法：
染色时间的掌握、冲洗的方法。
11、生化实验：
（1）接种的方法
（2）氧化型和发酵型实验操作
（3）阳性菌种的对照
（4）接种前的纯化。挑取单个菌落进行一系列的生化。
12、最适计数范围
霉菌菌落由孢子和菌丝组成，相当扩散，在直径9cm的平皿里，菌落数稍多就相互交叉重叠，影响计数，但数量太少又会产生较大的误差，因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。
我们对这方面作了一些观察研究，首先是将实验菌株的斜面培养物制成含有约106个/ml的孢子悬液，并用血球计数器在显微镜下准确计数，然后将孢子悬液作10-1~10-6倍稀释，吸取不同稀释度的稀释液接种于PDA，25℃培养5天后计数。30种常见霉菌的两种不同计数方法所得结果比较显示，大部分菌株每平板含有10~50个菌落的稀释度时的计数与显微镜计数结果最z接近；有近一半的菌株，每个平板含50~100个菌落已较难计数，而大部分菌株，超过100个/平皿或小于10个/平皿的计数结果就与显微计数结果存在较大差别，因此，应尽量选择10~50个/平皿的稀释度进行霉菌计数。
而对上述提及的菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株，则应在更少的范围内计数(30个/平皿以内)。为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范围，可在培养基中添加少量抗生素，如氯l霉素(50~100mg/L)，金霉j素(20~100mg/L)，庆大m霉素(50mg/L)，土霉m素(100mg/L)等。
13、关于杀菌的几个概念：
（1）抑制：是在亚抑制剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这些因子后生长仍可以恢复的生物学现象。
（2）死亡：在致死剂量因子的作用下或在亚致死剂量因子长时间的作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使移去这种因子后生长仍不能恢复的生物学现象。
（3）防腐：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或防止食物霉变。
（4）消毒：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有y病原微生物的一种措施，它可以起到防止感染和传播的作用。
（5）灭菌：利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有y病原微生物的一种措施。
（6）化疗：利用具有选择毒性的化学物质，例磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织或病变细胞进行治疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对有机体无毒害作用的治疗措施。
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