上海远慕生物科技有限公司

PCR失败的原因及改善方法
点击次数:73 更新时间:2024-05-28

  一 、模板质量问题:
  
  1)模板提取不完整,其中不含你的目的基因,或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA,PCR阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题,可以增加模板量试试,但不一定行得通。
  
  2)模板里面残留某种试剂成份,可能抑制Taq聚合酶的活性,如果是这种情况,可以用试剂盒把模板再纯化一下,或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。
  
  3) 为什么跑电泳会出现拖带呢?
  
  1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关,其中就有一个是电压,在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率,但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。
  
  2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后 ,按1:50 或1:100 等稀释后,再当成模板扩一次怎么样。
  
  二 、引物问题
  
  1)样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好,而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利!
  
  2)普通PCR所用的一对引物中有一个引物加多了,为正常的三倍只要引物特异性比较好,那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话,也许会扩出来非特异带。
  
  在制备单链探针时候就采取这样的不对称pcr,没关系的三Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。
  
  三、Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。
  
  四、模板浓度过低。
  
  五、退火温度过高。有可能,可以做个梯度PCR试一下。
  
  六、循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够。这个可能性不大。
  
  七、dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高,适合于用扩增掺入法标记生wu素及放射性元素。当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA(dNTP消耗一半),所以,你不小心多加了4倍的量,会很影响PCR结果,即Taq酶活力要降低20~30%,即底物抑制。
  
  八、PCR产物电泳
  
  1.电泳图不清晰,可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧。换新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试。
  
  marker都出问题说明是胶的问题,或者电泳操作的问题。
  
  2. PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。

上海远慕生物科技有限公司 版权所有 地址:上海市嘉定区曹安公路5588号 邮编:201202 电话: 管理登陆
传真:021-58999639 手机:13310162040 联系人:俞燕熙 邮箱:m13310162040@163.com  GoogleSitemap 网址:www.yuanmu-sh.com ICP备案号:沪ICP备14029423号-1
主营:ELISA试剂盒/染色液/溶液 /动物血清/标准品/化学试剂
点击这里给我发消息
手机:13310162040