四环素类抗生素的测定方法主要包括微生物抑制法、charmⅡ微生物受体分析法、酶联免疫法、分光光度法、毛细管电泳色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等。
样品经过提取和净化后，四环素类抗生素可通过薄层色谱或液相色谱进行分离，再采用分光光度、荧光或质谱检测系统进行定量测定。
微生物法是一种传统的测定四环素类化合物和其他抗生素的分析方法。微生物通常对四环素类抗生素具有固有的敏感性．对某些四环素别敏感，因而世界范罔内仍然在使用微生物抑制法。蜡状芽孢杆菌ATCC 11778是一种经典的用于分析四环索类的微生物，其对金/霉素的灵敏度为0.005 mg/L，对四环素和土/霉素的灵敏度为0．025 mg/L，对二甲胺四环素的灵敏度为0.001～0.002 mg/L。相对于其他分析方法，微生物抑制法操作简便，价格低廉，不需要精密仪器和复杂的样品前处理过程，因而适合大量样品的筛选。微生物抑制法的最大缺点是不能区分具体的四环素种类，因此也难以进行定量检测。
间接酶联免疫法可用来检测牛奶中的四环素类抗生素。四环素牛血清白蛋白共轭物用于抗体制备，同源的四环素-酪蛋白共轭物作为包埋试剂，而羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶作为第二抗体。牛奶样品经离心脱脂，采用磷酸盐缓冲液至少以l：30的比例进行稀释后，直接采用酶免疫法进行测定，检测限可达5 ng/g由于该法所采用抗体与金/霉素有强烈的交叉反应活性，因此，该法虽然不是用来检测四环素类的，但对于金/霉素的检测限也低达5 ng/g。刘智宏等建立了牛奶和鸡肉中四环素、土/霉素、金/霉素和多两环素的ELISA检测方法。该方法对牛奶和鸡肉中四环素的检测限为7μg/L(μg/kg)左右。由于存在交叉反应、假阳性率高等原因，免疫法一般作为四环素类物质检测的初筛方法。
