相信屏幕前的你，可能被 shRNA 干扰实验困扰了无数个日日夜夜......
亦或是屡屡想尝试，却次次与之失之交臂......
......被困扰的你是跪在哪一步了呢？
......而止步于起点的你又是因为什么呢？
今天写作这篇文章的目的呢，正是为帮助做实验的你缕清思路。让在干扰实验门口「探头」的你，系统的了解整个流程，从而让入门不再只是想象。
下面我要开始放大招了：
（一）shRNA 干扰机制＆shRNA 设计
shRNA（short/ small hairpin RNA）干扰机制图解
shRNA 组成：
shRNA 包括两个短的反向互补序列，中间由茎环（loop）序列分隔，组成发夹结构，随后连上 5～6 个 T（转录终止信号）
手动设计，原则：
A. 首先靶位点选择应该避开基因的非编码区；
B. 在正义链和反义链序列上不能出现连续 3 个或以上的 T，这可能导致 shRNA 转录的提前终止；
C. Stratagene 发现 29 个寡核苷酸抑制目的基因表达的效率比 23 个寡核苷酸的高；
D. 在启动子下游的酶切位点下方紧连一个 C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生；
E. shRNA 目的序列的个碱基必须是 G 以确保 RNA 聚合酶转录。如果选择的目的序列不以 G 开头，必须在紧连正义链的上游加一个 G；
F. shRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央，比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TTCAAGAGA3' 序列zui为有效；
G. 5～6 个 T 必须放置在 shRNA 插入片段尾部以确保 RNA 聚合酶III终止转录；
shRNA 设计好并合成之后，通过同源重组或者是酶切连接的方法进行干扰载体构建，构建成功后大量抽提质粒（去内毒素且 OD260/OD280 hao在 1.8 左右），以备转染。
