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简述核糖核酸酶的基本分类
点击次数:82 更新时间:2024-07-08

(一)核糖核酸酶A

核糖核酸酶A(RNase A)来源于牛胰脏,是一种内切核糖核酸酶,可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端,切割胞嘧啶或尿mi啶与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键,反应终产物是3’嘧啶核苷酸和末端带3’嘧啶核苷酸的寡核苷酸。无辅助因子及二价阳离子存在时,核糖核酸酶A的作用可以被胎盘RNA酶抑制剂(RNasin)或氧钒一核糖核苷复合物(vanadyl—ribonuclosidecomplex,VRC)所抑制。RNase A的反应条件极广,且极难失活。在低盐浓度(0~100 mmol/l NaCl)下,RNase A切割单链和双链RNA、DNA:RNA杂交体中的RNA;当NaCl浓度为300 mmol/l。或更高时,RNase A就特异性切割单链RNA。去除反应液中的RNase A,通常需要蛋白酶K处理、酚反复抽提和乙醇沉淀。在分子克隆中,核糖核酸酶A的主要用途为:

①从DNA:RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。

②确定RNA或DNA中的单碱基突变的位置。在RNA:DNA或RNA:RNA杂交体中,若存在单碱基错配,可用RNAse A识别并切割。通过凝胶电泳分析切割产物的大小,即可确定错配的位嚣。

③RNA检测。RNA酶保护分析法(RNase protection assay)是近年来发展起来的一种检测RNA的杂交技术。其基本原理是利用单链RNA探针,与待测的RNA样品进行杂交形成RNA:RNA双链分子,由于RNA酶可专一性地降解未杂交的单链RNA,而双链受到保护不被降解,经凝胶电泳可以确定目的RNA的长度。该方法灵敏度较Northern杂交法更高,并可进行较为准确的定量。选择适当的探针,还可进行基因转录起始位点分析及内含子(也称内元)剪切位点分析等研究。此法的灵敏度比核酸酶S1保护分析法高数倍。

④降解DNA制备物中的RNA分子。须使用无DNAsd的RNase(DNase I free RNase),市售的一般RNase A常含有DNase,可在100 retool/I Tris—CI(pH 7.5)和15 mmol/l。NaCI溶液中100℃加热15 min,以去除之。

(二)核糖核酸酶T1

核糖核酸酶T1(RNase T1)来源于米曲霉(Aspergillus orjzae),它特异地作用于鸟piao呤3’端磷酸,切割位点在鸟piao呤的3’磷酸和相邻核苷酸的5‘羟基之问的磷酸二酯键,反应终产物为3’鸟苷酸和末端带3’鸟苷酸的寡核苷酸片段。RNaseTl的反应条件极广,且极难失活,其催化活性类似于RNase A。

在RNA酶保护实验中,RNase T1与RNase A联合使用,对RNA进行定量和作图;还可用于去除DNA:RNA杂交体中未杂交的RNA区。

(三)核糖核酸酶H

核糖核酸酶H(RNase H)最早是从小牛胸腺组织中发现的,其编码基因已被克隆到大肠杆菌中。它能特异地降解DNA:RNA杂交双链中的RNA链,产生具有3’一OH和5’一磷酸末端的寡核苷酸和单核苷酸,它不能降解单链或双链的DNA或RNA。

在分子克隆中,核糖核酸酶H的主要用途是与大肠杆菌DNA聚合酶工和DNA连接酶一起参加cDNA克隆中第二条I)NA互补链的合成。当用逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA第一链之后,用RNase H部分消化mRNA:DNA杂交分子中的RNA,产生的RNA片段就像冈崎片段一样,作为大肠杆菌DNA聚合酶T的引物,以cDNA第一链为模板合成DNA,直到把mRNA全部代替。然后在DNA连接酶的作用下,封闭缺口形成双链cDNA。

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