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感受态菌的制备原理与操作步骤
点击次数:131 更新时间:2024-06-28

1.目的
学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。

2.原理
细菌在0℃ CaCl2低渗溶液中胀成球形,丢失部分膜蛋白,成为容易吸收外源DNA的状态。

3.器材
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,50ml 微量离心管,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,台式冷冻离心机,制冰机,恒温摇床,分光光度计,超净工作台,恒温培养箱,摇菌试管,三角烧瓶,接种环。

4.试剂
E. coli XL1-Blue,LB培养基,0.1 mol/L CaCl2溶液,无菌ddH2O

5.实验准备
1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌);平板培养基,LB培养基(灭菌),冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液(灭菌),无菌ddH2O,摇菌试管(灭菌),三角烧瓶(灭菌)。

6.操作步骤
(1)取一支无菌的摇菌试管,在超净工作台中加入2ml LB(不含抗菌素!)培养基。
(2)从超低温冰柜中取出XL1-Blue菌种,放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中,然后接入含2ml LB培养基的试管中,37℃摇床培养过夜。
(3)取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中,37℃下250r/min摇床培养2~3h,测定OD600为0.375(<0.4~0.6,细胞数<108/ml,此为关键参数!)。以下操作除离心外,都在超净工作台中进行。
(4)将菌液分装到1.5ml预冷无菌的聚丙烯离心管中,于冰上放置10min,然后于4℃,5000rpm离心 10min。
(5)将离心管倒置以倒尽上清液,加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液,立即在涡旋混合器上混匀,插入冰中放置30min。
(6)4℃,5000rpm离心10min,弃上清液后,用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬,插入冰中放置30min。
(7)4℃,5000rpm离心10min,弃上清液后,用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬,超净工作台中按每管100ml分装到1.5ml离心管中。可以直接用作转化实验,或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏(可存放数月)。
(8)在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面。

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