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超纯水中内毒素的定量测定实验
点击次数:66 更新时间:2024-06-11

革兰氏阴性菌,如大肠杆菌(E. coli)和假单胞菌(Pseudomonads)等的细胞壁成分被认为是内毒素。它们具有一个亲水性多糖和亲脂性脂质结构,有别于它们所源自的细菌,具有高度的热稳定性和pH稳定性。内毒素属于致热源,如果它们与粘膜发生接触或者一旦它们进入血液循环,便会导致发热(参考文献详见Steck, 20061)。

根据通用的药典,在药物的生产工艺中内毒素含量不可超出所规定的限值。

在生物制药(如:免疫球蛋白)生产所需的哺乳动物细胞培养中,内毒素的出现可能会导致死亡。因此,在生物制药生产、细胞系传代,或者细胞培养过程中需要使用超纯培养基,当然也相应的需要超纯水,它们所含有的内毒素含量水平已获证明低于所规定的限值。

本研究的目的在于展示Arium pro VF系统产生的超纯水所具有的内毒素含量远远低于规定的限值,因而可用于上述各种应用。

实验方法
为了对Arium pro VF系统所生产的超纯水中的内毒素含量进行检测,我们分别采用了凝胶法和显色法来测试。  

实验结果
在0.001 EU/ml-0.05 EU/ml的浓度范围内,凝胶法显示的是阴性结果,意即无凝胶形成(无内毒素检测到;见表1);当浓度≥0.1 EU/ml时发生了凝集反应。该结果显示了在凝胶法的检测敏感限值内,在Arium pro VF系统所生产的超纯水中未出现内毒素。
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显色法中,在405nm波长处的60吸附读数(见下图)根据标准样品中内毒素含量的不同生成了不同斜率的曲线。达到吸收率所需要的时间通过特殊的计算机程序进行计算,并将之用为推断具有未知内毒素含量的样品的依据(具体的值详见表1-显色测试)。由于具有最di低浓度(0.005-0.001 EU/ml)的标准样品和Arium水未达到所需的计算内毒素含量的消光值,因此它们被认定为低于检测限值。
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Arium pro VF超纯水所获得的值明显比0.001 EU/ml曲线的绘制点更加低。下图显示了与两个选定的内毒素标准(0.05 EU/ml and 0.005 EU/ml)相比,在自来水、去离子水(DI水)和Arium水中所测得的内毒素浓度的数据集合。在水样品中的内毒素含量通过使用内毒素标准所测得的值来计算,详见表2.

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在DI水样品中,检测到内毒素为0.02 EU/ml,这个值低于WFI(注射用水)现行的有效值。在自来水中,出乎意料地检测到高达25 EU/ml的内毒素载量。该结果未作进一步分析。与之相对,在系统所产生的超纯水中所检测到意料之外的低值,< 0.001 EU/ml,这个值远远低于常见的限值。

在DI水样品中,检测到内毒素为0.02 EU/ml,这个值低于WFI(注射用水)现行的有效值。在自来水中,出乎意料地检测到高达25 EU/ml的内毒素载量。该结果未作进一步分析。与之相对,在系统所产生的超纯水中所检测到意料之外的低值,< 0.001 EU/ml,这个值远远低于常见的限值。

结论
测试结果显示了Arium pro VF系统生产的超纯水可作为一种方便、实惠的选择,用于内毒素测试的样品制备,因为在其所生产的超纯水中检测到的内毒素浓度非常低(<0.001 EU/ml)。得到的结果也证实了早期关于在Arium超纯水中发现内毒素载量<0.001 EU/ml的试验。

在此超纯水中的内毒素浓度远远低于美国药典所规定的限值,这也使得该超纯水理论上适用于制药产品的生产/内毒素监测方面。相关的例子包括产品制剂,透析过滤解决方案,层析缓冲液以及用于萃取、清洗、无菌步骤和细胞培养方案的水等。

在细胞培养应用范围内,我们需要在工艺的各个步骤都对污染物保持高度警惕。为了对内毒素对细胞培养物及细胞敏感度的影响保持可控,尤其是与此类内毒素相关时,用于细胞培养的培养基都必须要明确不含可检测到的内毒素含量(见参考文献5)。

参考文献/更多信息
1 Steck, S. : Endotoxine und ihre Bedeutung bei R & D Applikationen. Bioforum 6/2006.
2 Endosafe® -PTS™ Glucan Assay, Charles River Laboratories International, Inc, 2009.
3 Endotoxin Compendium, V 2.11, Hyglos GmbH, Bernried, Germany.
4 Untersuchungsbericht Fresenius Medical Care, Deutschland GmbH, Werk St. Wendel, 2007.
5 Dawson, M.E. : LAL Update von Associates of Cape CodIncorporated, March 1998, Vol. 16, No. 1. Adapted from the original German article by Dr. Herbig, June 7, 2012

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