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浅谈蛋白样品制备方法
点击次数:59 发布时间:2022-06-29

蛋白质样品的制备,是蛋白质研究的第一步,不论后续采用何种分离或鉴定手段,样品制备都是重要步骤。

蛋白质样品制备的意义

生物的蛋白质种类多达 10 万种以上,样品中的蛋白质种类也可达到1万种以上,但大部分蛋白质的拷贝数很少,因此通过样品制备起到浓缩蛋白质的作用。
去除样品中各种非蛋白质的影响。
如何进行蛋白质的制备

蛋白样品制备包括蛋白质的分离,提取和纯化。从各类研究角度而言,样品制备都要尽可能获得所有样品中的蛋白质,但是由于蛋白质种类多,丰度不一,物化特性多样等因素,要到达真正的完全蛋白质制备是非常困难的。

在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面试验中弥补回来的!

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样品制备的原则:

尽可能采用简单的方法进行样品的制备。
尽可能提高样品的溶解度,使所有待分析的蛋白质样品全部处于溶解状态,且稳定可重复。
尽可能减少蛋白的降解。
根据下游实验选择决定提取蛋白的方法,例如提取变性还是活性蛋白,提取总蛋白还是亚细胞结构组分蛋白。
尽量去除干扰下游应用的杂质,包括但不仅限于核酸,组织碎片,或某些高丰度无关蛋白。
样品制备的基本流程:

样品的破碎
样品的裂解
杂质的去除及蛋白质溶液的获取
样品的破碎

为了完全分析细胞内蛋白,样品必须经过有效的破碎,破碎方法的选择依赖于样品来源不同(如组织,固定组织,难研磨组织,脂肪,菌体)而不同,同时也依赖于提取蛋白的类型(如是获取总蛋白还是特殊的亚细胞结构组分)。

通常组织样品和微生物样品都需要进行破碎处理,而细胞样品不需要。破碎可以通过渗透,冻融,酶解,超声,高压,液氮研磨,机械匀浆,玻璃珠匀浆等方式完成。选择破碎方式时也要考虑使用的裂解液配方是否可以完/美的配合,以得到最佳的提取效果。提取总蛋白时需要尽量的破碎样品释放蛋白,而特殊的亚细胞结构分离则需要根据提取方法采用合适的破碎方式。

提示:内源性的蛋白酶通常存在于细胞质内,在细胞破碎时可能会释放出来,导致某些蛋白质的降解,从而影响下游实验结果,因此可在细胞裂解前添加蛋白酶抑制剂加以保护。

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