核酸鉴定方法之浓度/纯度及完整性鉴定
点击次数：1022 更新时间：2022-05-19
核酸纯化在分子生物学实验室已经广泛应用。怎样获得高质量、高纯度的DNA或RNA样品对下游实验的顺利进行至关重要，因此，对纯化后的核酸进行鉴定也是必不/可少的步骤。本文简单的回顾学习一下核酸鉴定的方法。
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核酸鉴定包括：浓度/纯度鉴定+完整性鉴定
1.浓度/纯度鉴定
（1）紫外分光光度计：
原理：由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，吸收低谷在230nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。
由于核苷酸最大吸收波长为260nm,根据朗伯-比尔定律可计算出在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50?g/ml的双链DNA， 40?g/ml的单链RNA。紫外分光光度法只适用于测定浓度大于0.25?g/ml的核酸溶液。
计算公式:
dsDNA（?g/?l）=OD260x50x稀释倍数/1000
RNA（?g/?l）=OD260x40x稀释倍数/1000
纯净的DNA OD260/OD280=1.8，制备的样品DNA比值在1.7-1.9，若洗脱时不使用洗脱缓冲液而使用去离子水，比值会偏低，因为PH值和离子存在会影响光的吸收值。
当OD260/OD280< 1.7，表明蛋白质含量较高，可用利用酚、氯/仿、异/戊醇抽提，再用乙醇沉淀去除。
当OD260/OD280> 2.0，表明RNA含量较高。可用RNaseA消化后再进行纯化。
OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有碳水化合物、盐类或有机试剂污染。
