如何有效避免RNase污染看这篇
点击次数：437 更新时间：2022-01-14
自然界中许多生物会自主分泌RNase
RNase是生物体的“保护伞”，可防止外源RNA入侵。如：生物眼泪、唾液、汗液等体液中均会分泌RNase。
环境中的RNase稳定性非常好
环境中存在的RNase主要是由微生物(细菌和真菌)所分泌，由一种微小紧凑的蛋白组成。它的结构中具有二硫键，因此具有稳定性ji强的天然属性，极难灭活，热变性后也可以很快恢复构象。并且，RNase耐热、耐酸、耐碱，因此，它对众多去污方法均具有抵抗作用。
检测RNase污染的小Tips
由于RNase污染而导致实验失败，如何有效检测RNase污染源，是令实验人员头疼的事情。建议从以下几点进行排查：
检测缓冲体系、溶液：可启用全新批次的RNase-free试剂测试比对，也可检测疑似污染溶液中的RNase。
检测RNA样品：RNase进入RNA样本可在多种情况下发生，如RNA分离时(少量RNase在RNA制备过程中引入)，或日常取用时(会不可避免地需要重复开关样品管并插入可能被污染的加样枪头)。
可用GAPDH、cyclophilin、或beta-actin等管家基因的探针，通过northern分析来评估poly(A)RNA样品的完整性。
从源头开始，避免RNase的污染
RNase的无处不在，使得实验过程中，难以保存RNA样本的完整性。因此，可以从源头入手，一方面要严格控制外源性RNase的污染，另一方面要最大限度地抑制内源性的RNase。
常见的污染源及其控制方法：
外源性
外源性污染源：
体液、水与缓冲液等溶液，枪头，离心管。
控制外源性RNase污染的方法：
操作人员全副武装
在实验过程中戴手套可避免源自人手的RNase污染；触摸皮肤、门把手及普通物体表面后更换手套；
使用专业仪器与试剂
RNA操作专用的移液枪；使用RNase-free的枪头和离心管；使用RNase-free的化合物与试剂；
选择实验操作环境
远离/遮蔽通风孔或开放窗口，走动较少的区域作为RNase-free区域；
其他注意的点
在RNA提取和分析期间，不要进行其他可能引起RNase污染的实验。
内源性
内源性污染源：
所有组织样品均含有内源性RNase。
抑制内源性RNase活性的方法：
样本保存
组织取样后若不直接提取RNA，要及时用液氮迅速冷冻存于-80°C环境，并尽早进行实验，这样可使RNA的降解达到最少。
添加抑制剂
在细胞裂解液中加入RNase抑制剂(RNaseinhibitor)，使破碎细胞与灭活RNase同步进行，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNase的活性。
远慕RNase抑制剂可有效避免RNase污染
RNasin能够保护mRNA的完整，有利于提高转录及翻译的效率，同时避免了使用有机化合物抑制剂可能带来的影响。
RNasin是从人胎盘或大鼠肝中提取的一种特异的酸性糖蛋白。其分子量为51kDa，等电点pH值为4.7。RNasin对RNaseA、RNaseB或RNaseC抑制能力ji强，可快速特异地与它们以非共价键结合形成1:1的复合物，从而抑制RNase的活性，防止RNA被其降解。但需注意，RNasin不能抑制RNaseI、T1、T2、H、U1、U2和CL3的酶活性。
目前，RNasin主要用于cDNA合成，体外转录，体外翻译，以及mRNA-protein复合物分离纯化等过程中保护RNA不被降解；还可用于特定RNase活性的鉴定等。
