原代组织细胞的解离步骤
点击次数：1181 更新时间：2021-08-12
原代组织细胞的解离从原代组织上获取单个细胞悬液的常用方法是利用酶的解聚作用。尽量缩短用酶处理细胞的时间，以获得高的存活率。按下面的方法解聚整个组织，以获得大量细胞。
胰酶
1.先去除无关组织，然后用灭菌的解剖刀或剪刀将组织切成3-4mm大小碎块。通过在不含钙镁的平衡盐溶液进行重悬来清洗组织碎块。待组织碎块沉降后去掉上清液。重复清洗2-3次。
2.将装有组织碎块的容器置于冰上，去掉所有上清液。在不含钙镁的平衡盐溶液中加入0.25%胰酶(每100mg组织大约需要1ml 胰酶)。
3.在4℃ 下孵育6-18小时，使低活性的胰酶尽量渗入组织。
4.缓慢倒掉胰酶。在37℃ 下将残余的胰酶与组织碎块共同孵育20-30分钟。
5.向组织碎块加入温热的*培养基，并轻轻地吹吸以分散组织。如果使用无血清培养基。还应加入大豆胰酶抑制剂。
6. 用灭菌的不锈钢网(100-200μm)过滤细胞悬浮液，直至所有组织*散开。计算细胞个数，然后接种细胞进行培养。
胶原酶
1.用灭菌的解剖刀或剪刀将组织切成3-4mm大小碎块。用Hanks平衡盐溶液(HBSS)将组织碎块清洗数次。
2.加入胶原酶(50-200单位/ml胶原酶HBSS)。
3.在37℃ 下孵育4-18小时。加入3mM CaCl2 可以提高解离效率。
4.用灭菌的不锈钢网或尼龙网过滤细胞悬浮液，将离散的细胞和组织片段与大块的组织碎片分离。如需进一步解离，可向组织片段中加入新鲜的胶原酶。
5.通过离心HBSS清洗细胞悬浮液数次。
6.用培养基重悬细胞。计算细胞个数，然后接种细胞进行培养。
分散酶
1.用灭菌的解剖刀或剪刀将组织切成3-4mm大小碎块。用不含钙镁离子的平衡盐溶液清洗组织碎块数次。
2.加入分散酶(0.6-2.4单位/ml分散酶不含钙镁的平衡盐溶液)。
3.在37℃下孵育20分钟至数小时。
4.用灭菌的不锈钢网或尼友网过滤细胞悬浮液，将离散的细胞和组织片段与大块的组织碎片分离。如需进一步解离，可向组织片段中加入新鲜分散酶。
5.通过离心平衡盐溶液清洗细胞悬浮液数次。
6.用培养基重悬细胞。计算细胞个数，然后接种细胞进行培养。
